PPGCS/CCBS

Uma banca de QUALIFICAÇÃO de MESTRADO foi cadastrada pelo programa.
DISCENTE: LUIS DOUGLAS MIRANDA SILVA
DATA: 27/09/2017
HORA: 08:30
LOCAL: SALA 01 - PPGCS
TÍTULO: Duplo papel do óxido nítrico produzido por macrófagos M1, infectados por Leishmania amazonensis.
PALAVRAS-CHAVES: macrófagos, polarização, infecção, Leishmania amazonensis.
PÁGINAS: 46
GRANDE ÁREA: Ciências Biológicas
ÁREA: Imunologia
RESUMO: Os fagócitos são células essências na resposta a diversos tipos de infecções e dentre elas podemos destacar os macrófagos, os mesmos são caracterizados pela alta plasticidade o que possibilita a polarização rápida para perfis diferentes, com funções distintas. A literatura relata que a infecção por espécies de parasitos a exemplo da Leishmania sp., é capaz de induzir a polarização de macrófagos M1 para M2 com consequente agravamento da infecção. Dessa forma, o presente trabalho visa investigar especificamente a polarização de macrófagos M1 ou M2 durante infecção por Leishmania amazonensis. Para a realização dos ensaios, 1x106//mL de macrófagos RAW 264.7 foram cultivados em placas de 96 poços ou 1x105 células em 500µL para placas de 24 poços contendo lamínulas redondas de vidro com meio RPMI-1640 (suplementado com soro fetal bovino 1%) por 1 hora em estufa de CO2 a 5% e 37ºC. Após esse tempo, os macrófagos foram estimulados com LPS (2000ng/mL) mais IFN-γ (100ng/mL) para perfil M1 ou com IL-4 (400ng/mL) e IL-13 (200ng/mL) para M2, além de macrófagos que não receberam estímulos (M0) e incubados por 24 horas em estufa. Em seguida, os macrófagos M0, M1 e M2 foram co-incubados com L. amazonensis na proporção de 10 parasitos para 1 macrófago por 4hs, após o período de infecção, os poços foram lavados com meio para remoção dos parasitos extracelulares e incubados novamente em estufa por 24 horas. Para avaliação da taxa de infecção o número de parasitos intracelulares foi avaliado pela contagem de 100 macrófagos em microscópio óptico de campo claro, em aumento de 1000X, após a coloração das lâminas com hematoxilina-eosina. O sobrenadante da cultura foi utilizado para dosagem de óxido nítrico (NO) e quantificação das citocinas pela técnica de CBA. A avaliação da produção de peróxido de hidrogênio (H2O2) foi realizada via marcação por DHR (dihidrorodamina 123), enquanto a viabilidade dos macrófagos infectados foi feita pelo marcador de apoptose tardia e células mortas 7AAD. A expressão de iNOS, CD80/86 e F4/80 foram avaliados por imunofenotipagem. Nossos dados mostraram que a taxa de infecção pelo parasito foi maior nos macrófagos M1, além destes apresentarem aumento na produção de NO, estes dados estão correlacionados para este grupo. Os macrófagos M1 apresentam mortalidade inferior, além da baixa produção de peróxido de hidrogênio, diferentemente dos macrófagos M2 para estes dois dados. As citocinas inflamatórias (IL-6, TNF-α) e a quimiocina MCP-1, também mostraram-se aumentadas nos macrófagos M1, além de uma super expressão de iNOS, CD86/80 e F4/80 nestas células, quando co-incubados com o parasito. Com base nesses dados, podemos concluir que a infecção por L. amazonensis em macrófagos M1, demonstrou ser capaz de potencializar a produção de mediadores inflamatórios característicos desse fenótipo, onde vale destacar a de óxido nítrico, que pode estar agindo de forma supressora na atividade celular, durante a resposta ao parasito culminando na progressão da infecção.
MEMBROS DA BANCA:
Interno - 1136091 - PAULO VITOR SOEIRO PEREIRA