PPGCS/CCBS

Uma banca de QUALIFICAÇÃO de DOUTORADO foi cadastrada pelo programa.
DISCENTE: JOHNNY RAMOS DO NASCIMENTO
DATA: 05/02/2018
HORA: 09:00
LOCAL: PPGCS Sala 1
TÍTULO: INIBIÇÃO DA INOS: AÇÃO ANTITUMORAL E AMPLIFICAÇÃO DA POLARIZAÇÃO DE MACRÓFAGOS M1
PALAVRAS-CHAVES: óxido nítrico, macrófago M1, aminoguanidina, tumor de Ehrlich
PÁGINAS: 98
GRANDE ÁREA: Ciências da Saúde
ÁREA: Medicina
RESUMO: Os macrófagos possuem dois perfis extremos de ativação, macrófagos M1, classicamente ativados, secretam altos níveis de citocinas pró-inflamatórias, espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio, como o óxido nítrico (NO) e macrófagos M2, alternativamente ativados, secretam poliaminas e citocinas antiinflamatórias, atuando na depuração de parasita, remodelação dos tecidos e modulação imunológica. Apesar de serem considerados parte de uma resposta antitumoral, os macrófagos podem promover a iniciação, progressão e metástase do tumor através dos metabólitos produzidos por seus perfis de ativação. Dentre eles, o NO possuindo um papel dicotômico no controle de células malignas; estimulando ou inibindo o seu desenvolvimento de acordo com sua concentração e/ou origem. Com isso o objetivo deste trabalho é avaliar a inibição da produção de NO no desenvolvimento tumoral e na polarização de macrófagos. Para isso foi induzido a forma ascítica (TAE) e sólida (TSE) do tumor de Ehrlich. Para avaliar a inibição da produção de NO no TAE, foram medidos o peso e a medida da circunferência abdominal e acompanhada a sobrevida em camundongos Swiss, adultos (± 60 dias, 45 ± 5 g), machos, inoculados por via intraperitoneal com células do tumor de Ehrlich (2x106/animal) e tratados com uma solução aquosa de hemissulfado de Aminoguanidina (AG), um inibidor seletivo da iNOS, na dose de 100mg/kg, por via oral (v.o.). O grupo TUMOR não recebeu tratamento e o grupo CICLO foi tratado com ciclofosfamida monoidratada (Genuxal – Baxter Oncology) na dose de 25mg/kg, i.p. Na avaliação do desenvolvimento do TSE, foi inoculado 50µL de uma suspensão celular contendo 107 células/mL no coxin plantar de dezoito camundongos e 50µL de uma solução de PBS em seis camundongos. O tratamento foi realizado v.o. com AG na dose 100mg/Kg durante cinco primeiros dias a partir do inoculo (AGI) ou por cinco dias a partir do 10º dia após o inoculo (AGF). O grupo controle (C), sem tumor, e o grupo tumor (TU), com tumor, não receberam tratamento. A cada dois dias foi mensurada a espessura da pata dos animais e vinte dias após o inóculo do tumor os animais foram sacrificados e feita coleta do soro para as análises bioquímicas; amputação das patas para análise histopatológica e retirada dos órgãos linfóides (baço, linfonodo drenante e medula) para verificar a celularidade. Para as avaliações in vitro do efeito da inibição do NO na polarização de, incialmente foi avaliada a citotoxicidade da AG nas concentrações de 0,01; 0,1; 1 e 10Mm por 24 horas em macrófagos Raw 264.7 e qual a concentração que inibe totalmente a produção de NO em macrófagos M1 em 24 e 48 horas. Em seguida os macrofagos Raw 264.7 foram polarizados ou não para os perfis M1 (10ng/mL de Interferon-γ (IFN-γ) e 200ng/mL de lipopolissacarídeo (LPS)) e M2 (40ng/mL de interleucina-4 (IL-4) e 20ng/mL de interleucina-13 (IL-13)), tratados concomitantemente ou não com AG e mantidos em duas formas de cultura: primeira, com os estímulos e tratamento por 24 e 48 horas e segundo, previamente estimulados e tratados por 24 horas, com troca do sobrenadante por meio novo e mantidos por 24 e 48 horas . Foi realizada a imunofenotipagem dos marcadores de superfície, CD80 e CD86, e intracelular, iNOS, bem como a dosagem da produção de NO e das citocinas IL-6; IL-10; MCP-1; IFN-γ; TNF e IL-12p70. Os resultados obtidos demonstraram que as três formas de tratamento com o inibidor da iNOS não foi capaz de aumentar a sobrevida e nem a expectativa de vida dos animais portadores do TAE, não havendo alteração do peso e nem da medida da circunferência abdominal. Em relação aos animais portadores do TSE, foi observado que o grupo AGI foi capaz de retardar o crescimento tumoral. Na análise histopatológica foram encontradas várias figuram de mitose no grupo TU havendo uma redução nos grupos AGI e AGF. A presença de vasos sanguíneos foi maior no grupo TU que nos grupos AGI e AGF. Em todos os grupos houve um predomínio de infiltrado de células polimorfonucleares. A intensidade do infiltrado inflamatório do grupo AGI foi menor que a dos grupos TU e AGF. Na avaliação da celularidade dos órgãos linfoides, não houve alteração significativa do número de células do baço, ao passo que houve uma redução na celularidade do linfonodo drenante nos grupos AGI e AGF, em relação ao grupo TU e o tumor promoveu hipoplasia medular sendo mais intensa nos camundongos tratados com AG. Nos experimentos in vitro, a AG não foi capaz de polarizar macrófagos Raw264.7, não havendo produção de NO e nem alterando a produção de citocinas, bem como a expressão de CD80, CD86 e iNOS, o que foi observado também nos macrófagos tratados com AG e polarizados para o perfil M2. Entretanto, a inibição da iNOS em macrófagos polarizados para o perfil M1, nas culturas de polarização e tratamento concomitante por 24 e 48 horas, intensificou a expressão do CD80, CD86 e da iNOS, no entanto nas culturas onde houve a retirada dos estímulos e tratamento, o CD86 estava aumentado e o CD80 estava diminuído em 24 e 48 horas, por sua vez a expressão da iNOS estava aumentada em 24 horas e se igualando ao grupo não tratado em 48 horas. A produção das citocinas inflamatórias IL-6; MCP-1 e IL-12p70 e da reguladora IL-10 também foi aumentada. Macrófagos M1 com a iNOS inibida não produziram NO, na presença do inibidor em 24 e 48h, no entanto, na retirada do inibidor iniciaram a produzir NO, sendo equivalente em 24 horas e maior em 48 horas em relação ao grupo M1 não inibido. Estes resultados sugerem que o efeito antitumoral da inibição da iNOS, eficaz no início do desenvolvimento do TSE, se dá pela inibição da produção de NO nos macrófagos M1, nos quais, in vitro, há a intensificação da sua polarização sendo reversível com a ausência do inibidor e com isso havendo a retomada do desenvolvimento tumoral.
MEMBROS DA BANCA:
Interno - 3300875 - ANA PAULA SILVA DE AZEVEDO DOS SANTOS
Externo ao Programa - 2116833 - ARAMYS SILVA DOS REIS
Externo à Instituição - LÍDIO GONCALVES LIMA NETO - UNICEUMA